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人肝脏MST1相关miRNA的筛选、质粒构建与验证 预览
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作者 栾延松 李雨涵 +3 位作者 祁慧 李建宁 宋辉 杨怡 《宁夏医科大学学报》 2019年第5期433-439,共7页
目的构建与人肝脏丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(MST1)表达相关的人源性miRNAs(hsa-miRNAs)的重组质粒并进行初步验证,为深入探讨其在肝脏脂代谢途径中的可能作用奠定基础。方法通过TargetScan、miRDB等数据库并参照文献提供的数据库信息筛选... 目的构建与人肝脏丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(MST1)表达相关的人源性miRNAs(hsa-miRNAs)的重组质粒并进行初步验证,为深入探讨其在肝脏脂代谢途径中的可能作用奠定基础。方法通过TargetScan、miRDB等数据库并参照文献提供的数据库信息筛选出可能靶向人肝脏MST1的脂肪组织来源miRNAs,并通过Westernblot和双荧光素酶报告基因实验进行筛选;进而改建miRNAs过表达载体骨架,并将筛选得到的miRNAs构建过表达载体,获得miRNA的过表达重组质粒;采用棕榈酸(PA)孵育人肝癌细胞株HepG2构建非酒精性脂肪肝(NAFLD)细胞模型,并验证miRNAs对NAFLD细胞模型内MST1表达的调控效应。结果成功筛选出了靶向人肝脏MST1的miRNA:hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p,并构建了miRNAs过表达载体,在NAFLD细胞模型中验证了hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p过表达对脂代谢的影响。结论初步筛选并验证了调节人肝脏MST1表达的人源性miRNAs。证实hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p过表达通过下调MST1及相关信号通路的关键蛋白进而影响NAFLD的进程。 展开更多
关键词 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4 非酒精性脂肪肝病 MIRNA
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非酒精性脂肪肝病靶分子Mst1相关调节miRNA的筛选及鉴定 预览
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作者 李雨涵 栾延松 +3 位作者 祁慧 李建宁 宋辉 杨怡 《宁夏医科大学学报》 2019年第3期224-229,235共7页
目的探讨非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFDL)中Mst1的调控机制。方法利用TargetScan、miRDB等数据库从脂肪源性miRNAs中筛选出可能靶向鼠源Mst13’UTR区的miRNAs;通过Westernblot初步验证miRNA对Mst1的负性调控... 目的探讨非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFDL)中Mst1的调控机制。方法利用TargetScan、miRDB等数据库从脂肪源性miRNAs中筛选出可能靶向鼠源Mst13’UTR区的miRNAs;通过Westernblot初步验证miRNA对Mst1的负性调控效应;采用双荧光素酶报告基因技术确认miRNAs与Mst1的靶向关系;棕榈酸(PA)诱导AML-12小鼠肝脏细胞株成功构建NAFLD细胞模型,证实NAFLD模型中miRNAs通过调控Mst1影响NAFLD脂代谢进程。结果Westernblot实验显示miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691干预后Mst1的蛋白表达水平下调,Luciferases实验证明miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691存在直接靶向Mst1的效应,在NAFLD细胞模型中进一步证实miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691影响肝脏脂代谢进程。由此获得有潜在价值的负性调控miRNAs:miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691。结论miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691能够靶向并负性调控小鼠肝脏Mst1并参与NAFLD脂代谢进程。 展开更多
关键词 Mst1 非酒精性脂肪肝病 生物信息学 MIRNAS
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《生物化学》课程基于移动学习App的混合式教学模式探索 预览
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作者 张茜 姚青 +4 位作者 李建宁 罗明秀 杜星 燕晓雯 李燕 《医学教育研究与实践》 2019年第2期244-247,共4页
目的探讨基于移动学习App的混合式教学模式在《生物化学》课程教学中的应用。方法选取宁夏医科大学2017级护理专业82名学生为研究对象,护理1班采用混合式教学模式,护理2班采用传统的讲授教学模式,比较两组学生考核成绩和教学满意度的差... 目的探讨基于移动学习App的混合式教学模式在《生物化学》课程教学中的应用。方法选取宁夏医科大学2017级护理专业82名学生为研究对象,护理1班采用混合式教学模式,护理2班采用传统的讲授教学模式,比较两组学生考核成绩和教学满意度的差别。结果在考试成绩上,混合式教学组学生成绩与对照组相比,其差异无统计学意义(72.26±3.89比71.22±4.12,P=0.265)。教学满意度评价结果显示,在提高学习积极性,激发学生课堂学习氛围,提升学习效率和学习能力,促进语言表达能力,增加沟通交往能力方面,混合式教学组评分明显优于普通教学模式组,两组差异具有统计学意义(P<0.005)。结论本研究发现,基于移动学习App的混合式教学模式在《生物化学》课程教学中效果较好,学生满意度较高,在取得更多教学经验后,可以在今后的《生物化学》课程教学中推广。 展开更多
关键词 生物化学 移动学习 混合式教学 超星学习通
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大鼠杏仁核内Sirt1信号通路调控海洛因成瘾行为
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作者 张茜 王云鹏 +1 位作者 芦晓红 党伟 《中华精神科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期267-274,共8页
目的通过慢性海洛因给药分析杏仁核内Sirt家族表达变化,筛选在海洛因给药后具有显著表达改变的目标分子,继而干预杏仁核内目标分子Sirt1的表达,通过海洛因条件位置偏爱大鼠模型研究Sirt1对海洛因成瘾行为和下游分子表达调控作用。方法... 目的通过慢性海洛因给药分析杏仁核内Sirt家族表达变化,筛选在海洛因给药后具有显著表达改变的目标分子,继而干预杏仁核内目标分子Sirt1的表达,通过海洛因条件位置偏爱大鼠模型研究Sirt1对海洛因成瘾行为和下游分子表达调控作用。方法慢性海洛因给药组大鼠连续7 d腹腔注射5 mg/kg海洛因,采用逆转录-聚合酶链反应及蛋白质印迹法检测Sirt家族表达改变。定量染色质免疫沉淀检测ΔFosB对Sirt1的上游调控。过表达慢病毒和抑制剂EX527上调/下调杏仁核内Sirt1表达,观察海洛因条件位置偏爱行为及脑源性神经营养因子(BDNF)表达改变。结果慢性海洛因给药后,大鼠杏仁核内Sirt1 mRNA表达显著高于盐水对照组(t14=8.127,P<0.01),Sirt1 mRNA在海洛因注射后6 h(t14=4.997,P<0.05)、24 h(t14=9.711,P<0.01)、3 d(t14=5.407,P<0.05)表达升高。海洛因注射24 h后杏仁核内Sirt1(t14=5.016,P<0.01)和乙酰化组蛋白H3K9(t14=2.416,P<0.05)显著高于盐水对照组,结合于Sirt1启动子区的ΔFosB水平显著升高(t14=7.301,P<0.01)。大鼠杏仁核内注射Sirt1过表达慢病毒(OE-Sirt1)并未影响大鼠的自然偏爱,但在海洛因条件位置偏爱测试2中OE-Sirt1+海洛因组条件位置偏爱测试值显著高于OE-Sirt1+盐水组(t20=6.629,P<0.01);在条件位置偏爱测试1至测试4中EX527+海洛因组条件位置偏爱测试值与EX527+盐水组差异无统计学意义。OE-Sirt1+海洛因组与OE-Sirt1+盐水组BDNF表达分别为绿色荧光蛋白(GFP)+盐水组的(1.67±0.32)倍和(2.66±0.34)倍;EX527+海洛因组BDNF表达与EX527+盐水组差异无统计学意义。结论海洛因可能通过上调杏仁核内ΔFosB调控Sirt1表达,继而改变神经元染色质组蛋白乙酰化水平,影响BDNF等下游基因表达,从而引起海洛因成瘾行为变化。 展开更多
关键词 海洛因 杏仁核 条件位置偏爱 SIRT 组蛋白乙酰化
早期临床模式在医学生物化学教学中的应用 预览
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作者 李建宁 罗明秀 +2 位作者 张茜 姚青 杨怡 《基础医学教育》 2019年第9期693-695,共3页
以生物化学课程为重点的前提下,站在学生的视角将临床与基础进行有机的整合,更新授课切入点、重新组织课程,提前(早期)适度引入临床课程及实际临床工作中与生化课程内容密切相关的知识、理念、思维等,继而融合成模式与系统,从而达到激... 以生物化学课程为重点的前提下,站在学生的视角将临床与基础进行有机的整合,更新授课切入点、重新组织课程,提前(早期)适度引入临床课程及实际临床工作中与生化课程内容密切相关的知识、理念、思维等,继而融合成模式与系统,从而达到激发学生学习兴趣、提高学习效果的目的。 展开更多
关键词 生物化学 教学改革 早期临床
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Bcl-2、Bax、Insulin在高脂诱导C57BL/6J小鼠胰岛损伤中的表达 预览
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作者 马立荣 李建宁 +3 位作者 栾延松 李雨涵 宋辉 杨怡 《宁夏医科大学学报》 2018年第4期393-397,共5页
目的探讨细胞凋亡因子在高脂引起的小鼠胰岛损伤中的表达。方法雄性C57BL/6J小鼠分高脂饮食组(HFD)和低脂饮食对照组(LFD),每组6只,喂养12周时尾部取血进行葡萄糖耐量实验(GTT)及胰岛素耐量实验(ITT)检测胰岛功能。持续喂养至2... 目的探讨细胞凋亡因子在高脂引起的小鼠胰岛损伤中的表达。方法雄性C57BL/6J小鼠分高脂饮食组(HFD)和低脂饮食对照组(LFD),每组6只,喂养12周时尾部取血进行葡萄糖耐量实验(GTT)及胰岛素耐量实验(ITT)检测胰岛功能。持续喂养至20周时处死取胰腺组织用于透射电镜,苏木素-伊红(haematoxylineosin,HE)染色观察胰岛形态;免疫组化(immunohistochemical,IHC)检测Bcl-2、Bax及Insulin蛋白表达水平。结果喂养12周后,小鼠GTT和ITT显示,HFD组小鼠葡萄糖负荷时的血糖水平高于LFD组(P〈0.05)。注射胰岛素后,HFD组小鼠血糖下降缓慢且血糖水平仍较LFD组高(P〈0.05)。HE结果显示HFD组小鼠胰岛数量和体积较LFD组减少,形态损伤严重。电镜下观察HFD组胰岛β细胞超微结构受损较LFD组严重,HFD组β细胞形态不规则,细胞核固缩,染色质边集,有大量电子密度较小的脂滴堆积,其中胰岛细胞胞浆内胰岛素分泌颗粒减少。免疫组化的结果显示:HFD组Bcl-2表达低于低脂组,同时HFD组Bax表达高于LFD组,而HFD组胰岛中的Insulin表达低于LFD组(P〈0.01)。结论高脂导致C57BL/6J小鼠胰岛细胞结构功能损伤,影响胰岛素的合成与分泌,并且增加细胞凋亡。Bcl-2及Bax在胰岛细胞凋亡中起一定的作用,并可能与高脂饮食有关。 展开更多
关键词 高脂 胰岛损伤 细胞凋亡 胰岛素
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应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠海马神经元中Purα基因可减弱神经元对DNA损伤的修复作用
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作者 张冰莹 郭姗姗 +4 位作者 石晓光 何文欣 刘昆梅 孙涛 崔建奇 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2018年第5期706-716,共11页
人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。... 人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sg RNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在p Sp Cas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上,从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPR/Cas9质粒,将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定,将经过鉴定证实相位正确及在有sg RNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系。通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测Purα基因的表达情况,从而来判定Purα基因的敲除效率;将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲(HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。实验结果证实,所插入片段相位正确。通过TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可导致基因组碱基发生突变,Real-time PCR和Western blot实验结果证实,Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低。Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感,说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用,是细胞中一种不可或缺的蛋白质。该实验结果还提示,利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除,同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因,利用这一特点,可以方便地建立稳定的细胞系,该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 Purα 基因敲除 羟基脲 细胞损伤修复
高脂诱导小鼠肥胖模型中PPAR-γ激动剂对成熟脂肪细胞内JNK信号通路及visfatin分泌的作用研究 预览
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作者 李岩 宋辉 +4 位作者 李建宁 王青 李旺 贾丽 杨怡 《宁夏医科大学学报》 2017年第6期662-666,F0002共6页
目的探讨PPAR-γ激动剂罗格列酮对高脂诱导的成熟脂肪细胞内JNK信号通路和visfatin分泌的影响及作用机制。方法采用高脂饲料喂养C57BL/6小鼠24周建立体内肥胖模型,并同时给予3 mg·(kg·d)-1罗格列酮干预治疗;采用200μM棕榈... 目的探讨PPAR-γ激动剂罗格列酮对高脂诱导的成熟脂肪细胞内JNK信号通路和visfatin分泌的影响及作用机制。方法采用高脂饲料喂养C57BL/6小鼠24周建立体内肥胖模型,并同时给予3 mg·(kg·d)-1罗格列酮干预治疗;采用200μM棕榈酸诱导成熟3T3-L1脂肪细胞12h建立体外肥胖模型,并同时加入1-10μM PPAR-γ激动剂及5μM PPAR-γ抑制剂分别孵育细胞24h。检测细胞或血清中visfatin水平及JNK信号通路中相关分子表达和含量,评价PPAR-γ激动剂对JNK信号通路及visfatin的调节作用。结果在细胞模型中,PPAR-γ激动剂呈剂量依赖性上调PPAR-γ核表达,而下调phospho-JNK表达,同时增加了细胞内visfatin的释放(P〈0.05);PPAR-γ抑制剂和PPAR-γ小分子干扰RNA的效应则与PPAR-γ激动剂截然相反(P〈0.05或〈0.01)。在动物模型中,PPAR-γ激动剂增加了高脂诱导小鼠脂肪组织中PPAR-γ及visfatin的mRNA水平(P〈0.05),且visfatin与PPAR-γmRNA水平呈正相关(r2=0.92,P〈0.01)。与此同时,PPAR-γ激动剂降低了JNK通路相关炎性分子TNF-1α、MCP-1及IL-6的表达及含量(P〈0.05或〈0.01)。结论 PPAR-γ激动剂有潜在的抗炎和调节visfatin分泌的作用。 展开更多
关键词 JNK PPAR-Γ PPAR-Γ激动剂 VISFATIN 脂肪细胞 高脂
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含Egr-1基因启动子的报告质粒的构建及Purα对Egr-1基因表达的调控 预览
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作者 袁程敏 柴娟 +6 位作者 李平 张冰莹 郭姗姗 何文欣 石晓光 孙涛 崔建奇 《宁夏医科大学学报》 2017年第4期368-373,共6页
目的探讨人转录活化因子阿尔法又称富含嘌呤成份(或元件)结合蛋白(human transcriptional activator alpha,also named as purine-rich element binding protein alpha,Purα)对早期生长反应蛋白-1(Egr-1)基因表达的调控作用。方... 目的探讨人转录活化因子阿尔法又称富含嘌呤成份(或元件)结合蛋白(human transcriptional activator alpha,also named as purine-rich element binding protein alpha,Purα)对早期生长反应蛋白-1(Egr-1)基因表达的调控作用。方法利用PCR技术从U87MG细胞基因组DNA中扩增Egr-1基因启动子近5’端约700bp的DNA片段,将扩增的DNA片段克隆到萤火虫荧光素酶报告基因载体p GL3-Basic的相应酶切位点,构建成含有Egr-1启动子的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL3-Basic-Egr-1)并通过酶切和测序进行鉴定。通过萤火虫荧光素酶实验对p GL3-Basic-Egr-1启动子的活性进行测定并检测Purα蛋白对p GL3-Basic-Egr-1启动子活性的作用。通过q PCR和Western blot实验检测Purα蛋白在转录和翻译水平对Egr-1基因表达的调控作用。结果通过序列测定和酶切分析证实所构建的含Egr-1基因启动子的报告载体与实验设计完全一致,萤火虫荧光素酶分析实验证实所构建的p GL3-Basic-Egr-1启动子序列正确并具有活性,Purα蛋白可以抑制p GL3-Basic-Egr-1启动子的活性,过表达Purα可以在转录和翻译水平下调Egr-1基因的表达。结论 Purα蛋白具有下调Egr-1基因表达的作用。 展开更多
关键词 Purα 早期生长反应蛋白-1 基因表达调控 阿尔茨海默病
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利用CRISPR/Cas9技术构建CREB基因敲除细胞系并探讨CREB对APP基因表达的调控作用 被引量:1
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作者 郭姗姗 张冰莹 +4 位作者 何文欣 石晓光 刘昆梅 孙涛 崔建奇 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2017年第9期1147-1155,共9页
环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP responsive element-binding protein,CREB)是重要的核转录因子,有研究表明,在阿尔茨海默病患者中,CREB的表达降低,但CREB对于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的作用机制尚不清楚。... 环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP responsive element-binding protein,CREB)是重要的核转录因子,有研究表明,在阿尔茨海默病患者中,CREB的表达降低,但CREB对于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的作用机制尚不清楚。该研究通过设计sg RNA序列并合成相应的寡核苷酸,将其克隆到p X459质粒中,构建CREB基因敲除的CRISPR/Cas9二合一表达载体。将构建成功的载体转染到HT22细胞中,通过TA克隆测序和T7E1酶切分析来验证sg RNA的活性。将构建的载体转染到HT22细胞中,用嘌呤霉素进行药物筛选,构建稳定的CREB基因敲除的细胞系。CREB对APP基因表达的调控作用通过检测其在正常HT22细胞和CREB基因敲除的HT22细胞系中的表达情况来进行确认。结果显示,成功构建了CRISPR/Cas9技术对CREB基因进行敲除的二合一表达载体,所设计的sg RNA的插入序列和开放阅读框架完全正确,经过酶切分析和序列测定,所构建的载体与实验设计相一致。CREB基因敲除的HT22细胞系其敲除效率达到90%以上。通过Western blot分析检测CREB对APP表达的影响,结果发现,当CREB基因敲除后,APP表达增加,而过表达CREB时,则APP蛋白质表达水平下降。这提示,CREB对APP的表达有下调作用,具体的机制还将继续研究。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 CREB 基因敲除 APP基因表达 阿尔茨海默病
MST1过表达对棕榈酸诱导非酒精性脂肪肝细胞模型脂滴生成的影响 预览 被引量:3
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作者 王青 贾丽 +6 位作者 李旺 祁慧 宋辉 李岩 李建宁 马立荣 杨怡 《宁夏医科大学学报》 2016年第4期381-385,481共6页
目的通过构建哺乳动物STE20相关激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)过表达慢病毒,探讨MST1对棕榈酸孵育的HepG2细胞内脂滴生成的影响。方法构建MST1过表达载体,与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,获取慢病毒颗粒并检测其... 目的通过构建哺乳动物STE20相关激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)过表达慢病毒,探讨MST1对棕榈酸孵育的HepG2细胞内脂滴生成的影响。方法构建MST1过表达载体,与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,获取慢病毒颗粒并检测其滴度。利用250μM棕榈酸诱导HepG2细胞,将MST1过表达慢病毒(LV-MST1)和对照慢病毒(LV-control)分别感染细胞。Western blot检测感染细胞中MST1的表达水平;利用油红O染色观察与检测细胞中脂滴的生成情况;利用细胞甘油三酯酶法检测细胞中甘油三酯的含量。结果成功获得MST1过表达慢病毒,其滴度达1×10~6TU/μL以上。Western blot检测显示MST1过表达的HepG2细胞中MST1的表达水平明显升高,脂滴生成和甘油三酯含量比对照组明显减少(P<0.05或<0.01)。结论成功构建MST1过表达慢病毒,MST1过表达明显抑制棕榈酸诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型的脂滴生成。 展开更多
关键词 慢病毒载体 脂滴 非酒精性脂肪肝 MST1过表达 棕榈酸
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胎牛血清联合FSH对玻璃化冻存小鼠卵巢的保护作用 预览 被引量:1
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作者 苏芹 裴承斌 +4 位作者 张淑雅 罗晓强 徐荣荣 王燕蓉 裴秀英 《宁夏医科大学学报》 2016年第6期629-633,598共6页
目的观察玻璃化冻存液中联合添加促卵泡刺激素(follicle-stimulatiny hormore,FSH)与胎牛血清对卵巢的保护作用,为优化卵巢玻璃化冷冻保存技术提供科学依据。方法将3周龄雌性ICR小鼠卵巢分为新鲜对照组(FCG)、空白对照玻璃化冻存组(B-V... 目的观察玻璃化冻存液中联合添加促卵泡刺激素(follicle-stimulatiny hormore,FSH)与胎牛血清对卵巢的保护作用,为优化卵巢玻璃化冷冻保存技术提供科学依据。方法将3周龄雌性ICR小鼠卵巢分为新鲜对照组(FCG)、空白对照玻璃化冻存组(B-VCG)、FSH干预玻璃化冻存组(FSH-VCG)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)干预玻璃化冻存组(FBS-VCG)、FBS联合FSH干预玻璃化冻存组(FBS+FSH-VCG)5组,采用卵泡计数方法计算正常卵泡率,采用免疫组织化学方法及蛋白免疫印迹技术观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果 FBS+FSH-VCG组的正常卵泡百分比高于B-VCG组(P=0.012),FBS+FSHVCG组和FBS-VCG(P=0.751)和FSH-VCG(P=0.693)组比较差异无统计学意义(P>0.05);与FCG组相比,玻璃化冻存各组卵巢组织内的凋亡蛋白Bax表达均升高(P均<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达均减少(P均<0.05);与B-VCG组比较,FBS-VCG、FSH-VCG和FBS+FSH-VCG组的Bcl-2蛋白表达较高(P均<0.05),Bax蛋白表达率较低(P均<0.05);在FBS+FSH-VCG组中,Bcl-2/Bax比值大于1,Bcl-2表达占优势,与B-VCG组相比差异有统计学意义(P=0.034),FBS+FSH-VCG组与FCG组Bcl-2表达相似。结论小鼠卵巢组织玻璃化冻存过程中胎牛血清和FSH的添加可以减少对卵巢组织的冷冻损伤,提高正常卵泡百分比,二者联合添加对卵巢的保护效果最好。 展开更多
关键词 玻璃化冻存 小鼠卵巢 正常卵泡百分比 胎牛血清 FSH BCL-2/BAX
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犬博卡病毒结构基因VP2多克隆抗体的制备与应用
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作者 张茜 闫琰 +4 位作者 马婧 李建宁 张薇 黄菱 孙玉宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期253-257,共5页
目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ... 目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ET-32a(+)-VP2,转化至E.coli BL21中,异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物SDS-PAGE分析鉴定;纯化融合蛋白后免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,检测抗体效价及特异性。结果通过酶切和测序证实成功构建原核表达载体p ET-32a(+)-VP2,转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶6 400 000,Western blot法及免疫荧光染色鉴定抗体的特异性。结论成功制备了抗CBV结构蛋白VP2的多克隆抗体。 展开更多
关键词 犬博卡病毒(CBV) 结构基因VP2 多克隆抗体
南亚留学生医学生物化学中实施人性化教学探讨 预览 被引量:1
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作者 李建宁 张茜 +2 位作者 杨怡 姚青 孙玉宁 《基础医学教育》 2016年第6期487-489,共3页
文章针对临床专业南亚留学生,从医学院校医学生物化学课程教学入手,结合实际教学经验与多种具体案例进行讲解,通过对理论课授课各个教学环节的分析,多层次、多方面阐述理论课人性化教学的重要性及应用。
关键词 医学生物化学 人性化教学 南亚留学生
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沉默信息调节因子1慢病毒表达载体的构建及其在视网膜神经节细胞中的表达
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作者 姚青 张继荣 +3 位作者 杨怡 张茜 李建宁 孙玉宁 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期66-69,共4页
目的构建沉默信息调节因子1(sirtl)过表达慢病毒载体,观察其在体外培养的视网膜神经节细胞(RGC)中的表达。方法构建大鼠sirtl cDNA的过表达慢病毒载体,采用PCR鉴定其是否构建成功。同时将其与OenBank 上 sirtl cDNA标准序列进行... 目的构建沉默信息调节因子1(sirtl)过表达慢病毒载体,观察其在体外培养的视网膜神经节细胞(RGC)中的表达。方法构建大鼠sirtl cDNA的过表达慢病毒载体,采用PCR鉴定其是否构建成功。同时将其与OenBank 上 sirtl cDNA标准序列进行对比分析。将鉴定后的慢病毒重组表达质粒pLV5 sirtl与包装质粒共转染293T细胞,制备携带siftl的慢病毒pLV5-sirtl。体外培养Sprague-Dawley大鼠的RGC,应用pLV5-sirtI感染细胞设为sirtl过表达慢病毒组,同时设未感染组和空载体感染组。采用荧光显微镜观察细胞感染效率,实时PCR和蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测sirtlmRNA和蛋白表达水平。结果PCR鉴定结果显示,在1680碱基对处有扩增条带,表达的DNA条带与sirtl目的片段大小一致。与GenBank上sirtlcDNA标准序列进行对比分析,测序结果显示其含有与设计相同的靶序列。荧光显微镜观察发现,空载体感染组和sirtl过表达慢病毒组均可看到绿色荧光,感染效率在90%以上。实时PCR检测结果显示,sirtl过表达慢病毒组sirtlmRNA表达水平较未感染组、空载体感染组均明显升高,差异有统计学意义(P〈0.05)。Westernblot检测结果显示,sirtl过表达慢病毒组sirtl蛋白表达水平较未感染组、空载体感染组均明显升高,差异有统计学意义(P〈0.05)。结论成功构建的大鼠sirtl过表达慢病毒载体能够在体外有效感染大鼠RGC,提高sirtl在RGC中的表达水平。 展开更多
关键词 沉默信息调节蛋白质类 酿酒酵母 视网膜神经节细胞 慢病毒感染 细胞 培养的
医学院校研究生联合培养模式的思考 预览 被引量:1
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作者 张琳娜 陶虹 +2 位作者 余强 崔建奇 扈启宽 《基础医学教育》 2015年第1期92-94,共3页
随着研究生招生规模不断扩大,各院校对研究生的管理和培养模式也不断有新的要求。其中联合培养的模式备受青睐,针对这种新型的培养模式,从多角度对其存在的必要性以及优越性进行了探讨。
关键词 高等教育 研究生教育 联合培养
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内源性保护蛋白Iduna在抑制大脑神经元parthanatos中的作用 被引量:1
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作者 俞一瑾 赵薇 倪新莉 《国际麻醉学与复苏杂志》 CAS 2015年第4期374-376,381共4页
背景 Parthanatos是新近发现的一种与人类多种疾病有关,通过激活多聚腺苷二磷酸(ADP)核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]引发,不同于坏死、凋亡和自噬的新的细胞死亡形式.目前发现N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-as... 背景 Parthanatos是新近发现的一种与人类多种疾病有关,通过激活多聚腺苷二磷酸(ADP)核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]引发,不同于坏死、凋亡和自噬的新的细胞死亡形式.目前发现N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)预处理可诱导产生一种内源性存活蛋白Iduna,通过与多聚ADP核糖聚合物(poly ADP-ribose,PAR)结合,有效干预兴奋毒性引起的神经细胞parthanatos死亡.目的 了解内源性保护蛋白Iduna在抑制大脑神经元parthanatos中的作用.内容 就细胞发生parthanatos的可能机制,以及内源性抑制蛋白Iduna如何作用于PARP-1通路产生脑保护作用最新研究进展作一综述.趋向 随着对Iduna研究的不断深入,临床治疗parthanatos相关疾病的方法也会不断涌现. 展开更多
关键词 parthanatos 多聚ADP-核糖聚合酶1 Iduna
类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞中膜联蛋白A2磷酸化修饰增强基质金属蛋白酶9的活性 被引量:2
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作者 赵薇 穆楠 +2 位作者 舒震 张昭 张伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1363-1366,1371共5页
目的 研究膜联蛋白A2(ANXA2)磷酸化修饰对类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RAFLS)基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9水平及活性的影响。方法 原代培养RAFLS, 构建包装ANXA2干涉慢病毒, 制备ANXA2显著下调的FLS(siANXA2/FLS)及... 目的 研究膜联蛋白A2(ANXA2)磷酸化修饰对类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RAFLS)基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9水平及活性的影响。方法 原代培养RAFLS, 构建包装ANXA2干涉慢病毒, 制备ANXA2显著下调的FLS(siANXA2/FLS)及同型对照作为细胞模型, 采用2型胶原蛋白刺激法间接磷酸化RAFLS中的ANXA2。实时定量PCR(qRT-PCR)分析ANXA2磷酸化对RAFLS细胞中MMP-2和MMP-9表达的影响, 明胶酶谱实验观察ANXA2活化对RAFLS中MMP-2和MMP-9活性的影响。结果 qRT-PCR结果提示ANXA2磷酸化修饰对RAFLS中MMP-2和MMP-9的水平无显著影响, 明胶酶谱实验显示ANXA2磷酸化修饰能够增强MMP-9的活性。结论 通过胶原蛋白刺激法间接促进RAFLS中ANXA2的磷酸化修饰, 显著增强MMP-9的活性。 展开更多
关键词 类风湿性关节炎 成纤维样滑膜细胞 膜联蛋白A2 基质金属蛋白酶9 明胶酶谱
犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定 预览 被引量:2
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作者 闫琰 张茜 +3 位作者 马婧 李建宁 张薇 孙玉宁 《吉林大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期864-869,I0006共7页
目的:制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定。方法:以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达... 目的:制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定。方法:以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NP1蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备NP1抗血清并用ELISA法测定抗血清效价。采用Western blotting和免疫荧光法检测NP1抗血清的特性。结果:成功构建MVC NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的NP1融合蛋白,以其免疫大白兔获得NP1多抗血清,ELISA法检测效价达到1∶400 000。Western blotting法及免疫荧光检测,所得抗血清具有较高的效价及特异性。结论:本研究利用原核表达的MVC GST-NP1融合蛋白制备的NP1抗血清效价高、特异性高,为进一步深入研究NP1在MVC感染及致病分子机制中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 犬博卡病毒 NP1基因 多克隆抗体
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重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的构建及应用
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作者 赵薇 张昭 +3 位作者 黄同列 穆楠 田菲 张伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1234-1237,共4页
目的构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-Fc DDR2),检测其自主磷酸化水平。方法设计Fc DDR2克隆引物,以质粒pSec Tag2B-Fc DDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的c DNA序列(Fc DDR2... 目的构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-Fc DDR2),检测其自主磷酸化水平。方法设计Fc DDR2克隆引物,以质粒pSec Tag2B-Fc DDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的c DNA序列(Fc DDR2),将其插入pFLAG-CMV2真核表达载体中。PCR扩增鉴定并测序验证重组质粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2后,将其转染人胚肾HEK293T细胞,Western blot法验证HEK293T细胞中目标蛋白Fc DDR2的表达效率。将pcDNA3.1-DDR2转染HEK293T细胞,给予2型胶原蛋白刺激后作为阳性对照,用小鼠来源抗DDR2抗体免疫沉淀pFLAG-CMV2-Fc DDR2阳性的HEK293T细胞及胶原刺激的pcDNA3.1-DDR2阳性的HEK293T细胞,4G10抗体分析DDR2的磷酸化水平,评价Fc DDR2的自主磷酸化能力。结果重组质粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2的PCR扩增产物为大小约2800 bp左右的片段,与预期相符,测序验证正确。Western blot结果提示pFLAG-CMV2-Fc DDR2转染后的HEK293T细胞,FLAG-Fc DDR2表达水平显著上调。免疫沉淀结合Western blot分析提示FcDDR2的磷酸化水平与胶原刺激后的DDR2水平相当。结论成功构建了pFLAG-CMV2-FcDDR2真核表达载体,Fc DDR2的自主磷酸化与胶原蛋白刺激后DDR2的活化水平相当,可以用作DDR2经胶原蛋白刺激后的活化替代形式。 展开更多
关键词 重组质粒 FcDDR2 HEK293T细胞 胶原刺激 磷酸化
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