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乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗对猪体的免疫效果
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作者 肖朋朋 刘昊 +7 位作者 靖杰 韩继成 曹亮 李成辉 张金勇 李一权 鲁会军 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期244-249,共6页
重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE投入使用之前需要进行本体动物免疫和攻毒保护试验,本研究将重组痘苗病毒rVTT-JEVE进行仔猪免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果,并检测攻毒后仔猪体内乙型脑炎病毒载量,分析讨论乙型... 重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE投入使用之前需要进行本体动物免疫和攻毒保护试验,本研究将重组痘苗病毒rVTT-JEVE进行仔猪免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果,并检测攻毒后仔猪体内乙型脑炎病毒载量,分析讨论乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE对猪体的免疫效果。经2次仔猪免疫接种后,重组痘苗病毒rVTT-JEVE组的IgG抗体水平是商品疫苗SA-14-14-2组的1.5倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05),而且rVTT-JEVE组的中和抗体效价达到SA-14-14-2组的1.7倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05)。rVTT-JEVE组的T淋巴细胞刺激指数为SA-14-14-2组的1.6倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05)。本研究结果显示,rVTT-JEVE候选疫苗组和SA-14-14-2商品疫苗组JEV病毒载量均显著低于PBS对照组(P<0.05),均可有效保护仔猪感染JEV。 展开更多
关键词 重组痘苗病毒rVTT-JEVE 仔猪 乙型脑炎病毒 免疫评价
麻鸭源禽痘病毒的形态观察、分离鉴定及动物试验
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作者 张红云 郑敏 +4 位作者 罗满林 韦英益 孙文超 朱远致 辛佳亮 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1466-1471,共6页
旨在对麻鸭源禽痘病毒进行分离鉴定,并对其组织嗜性和易感动物进行初步探索。用荧光定量PCR方法检测广西邕宁发病麻鸭皮肤痘疹样本,结果显示,呈鸭源禽痘病毒阳性;电镜观察负染标本和超薄切片,病毒粒子符合典型的痘病毒形态特征;HE染色... 旨在对麻鸭源禽痘病毒进行分离鉴定,并对其组织嗜性和易感动物进行初步探索。用荧光定量PCR方法检测广西邕宁发病麻鸭皮肤痘疹样本,结果显示,呈鸭源禽痘病毒阳性;电镜观察负染标本和超薄切片,病毒粒子符合典型的痘病毒形态特征;HE染色镜检组织切片,符合痘病毒感染的病理学特征;利用SPF鸭胚和鸭胚成纤维细胞进行病毒分离,经IFA和PCR方法检测证实成功分离到1株麻鸭源禽痘病毒;对麻鸭15种组织597份样本进行检测,发现痘疹中病毒含量最高,其次为食管、喉头、气管,而在肠道和法氏囊中未检测到病毒;同居感染试验发现麻鸭、阳江鹅和樱桃谷鸭均可感染该病毒,而鸡和番鸭未见感染。结果为鸭源禽痘病毒的生物学特性、组织嗜性和宿主范围研究,以及其诊断和防控提供理论依据。 展开更多
关键词 麻鸭 禽痘病毒 分离鉴定 组织嗜性 宿主范围
寨卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME构建及新型佐剂的筛选
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作者 刘云霞 田明尧 +5 位作者 哈卓 曹亮 郭丹丹 孙文超 鲁会军 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1135-1139,共5页
选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋... 选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与重组的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过细胞亚群检测、淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果显示,Western blot检测所构建的DNA疫苗表达68 000目的蛋白。用重组疫苗辅以佐剂免疫小鼠,免疫35 d时淋巴细胞增殖刺激组刺激指数、细胞亚群分化、特异性抗体水平均高于对照PBS组(P<0.05)。结果表明,DNA疫苗pVAX-ZikaME辅以新型佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。 展开更多
关键词 新型佐剂 寨卡病毒 ME蛋白 DNA疫苗
猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测
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作者 赵冠宇 解长占 +12 位作者 孙文超 张赫 那少龙 李卓昕 张涵 李成辉 哈卓 李金凤 韩继成 南福龙 庄忻雨 张英 金宁一 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2019年第10期1885-1889,共5页
采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验... 采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。 展开更多
关键词 猪细小病毒7型 实时荧光定量PCR 衣壳蛋白基因
寨卡病毒DNA疫苗新型佐剂的筛选
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作者 刘云霞 秦宇豪 +7 位作者 张聪 曹亮 汪伟 郭丹丹 孙文超 鲁会军 田明尧 金宁一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第3期253-256,263共5页
目的以卡波姆971p辅以国产白喉、百日咳、破伤风灭活疫苗及Poly(I:C)配制成新型佐剂,与DNA疫苗pVAX-Zika-E联合免疫BALB/c小鼠,观察新型卡波姆佐剂对DNA疫苗抗原的适应性及免疫应答能力。方法 PCR扩增ZIKA E蛋白基因,连接到pVAX-1载体上... 目的以卡波姆971p辅以国产白喉、百日咳、破伤风灭活疫苗及Poly(I:C)配制成新型佐剂,与DNA疫苗pVAX-Zika-E联合免疫BALB/c小鼠,观察新型卡波姆佐剂对DNA疫苗抗原的适应性及免疫应答能力。方法 PCR扩增ZIKA E蛋白基因,连接到pVAX-1载体上,构建表达ZIKA E蛋白的DNA疫苗。将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与表达ZIKA E蛋白的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠。通过淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果 Western blot结果显示所构建的DNA疫苗pVAX-ZIKA-E表达56×103目的蛋白。用重组疫苗做动物试验,免疫35 d时佐剂组淋巴细胞增殖刺激组刺激指数是无佐剂对照组的1.30~1.55倍,特异抗体水平(A450值)是无佐剂组对照组的1.27~1.50倍。结论 pVAX-ZIKA-E DNA疫苗辅以新型卡波姆佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。 展开更多
关键词 佐剂 寨卡病毒 DNA疫苗
山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法的建立 预览
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作者 孙文超 张世亨 +12 位作者 易驰喆 黄海鑫 张红云 汪伟 曹亮 闭璟珊 郑敏 鲁会军 韦显凯 苏姣秀 赵翠青 陈征 王茂鹏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期138-144,共7页
目的在mRNA水平对山羊Th1/Th2型细胞因子进行定量分析,建立山羊Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量检测方法。方法根据GenBank山羊Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子基因保守序列设计引物,以标准阳性质粒为模板分别进行荧... 目的在mRNA水平对山羊Th1/Th2型细胞因子进行定量分析,建立山羊Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量检测方法。方法根据GenBank山羊Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子基因保守序列设计引物,以标准阳性质粒为模板分别进行荧光定量PCR反应的标准曲线、溶解曲线建立。结果山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R2均大于0.985,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰;利用N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒(△N1L株)与山羊痘AV41株感染山羊外周血淋巴细胞进行IL-4和IFN-γmRNA表达水平检测,△N1L株与山羊痘AV41株均能能够刺激机体IL-4和IFN-γ细胞因子,但二者差异无统计学意义(t=3.333,P﹥0.5)。结论本研究建立山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测,为山羊痘基因工程疫苗的研究奠定基础。 展开更多
关键词 山羊 TH1/TH2型细胞因子 SYBR Green I REAL-TIME PCR
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猪肠道α冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立 预览
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作者 赵冠宇 黄海鑫 +11 位作者 张世亨 赵翠青 陆祎婷 夏秀秀 倪铭 李笨 汪伟 曹亮 郑敏 孙文超 鲁会军 金宁一 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期35-39,共5页
为建立猪肠道α冠状病毒(SeACoV)荧光定量检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增SeACoV N基因保守区序列,将其克隆至p EASY-Blunt载体,构建重组质粒p EASY-Blunt-PA-N作为标准阳性质粒,以其为模板建立SeACoV的SYBR Green I荧光定量PCR检测... 为建立猪肠道α冠状病毒(SeACoV)荧光定量检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增SeACoV N基因保守区序列,将其克隆至p EASY-Blunt载体,构建重组质粒p EASY-Blunt-PA-N作为标准阳性质粒,以其为模板建立SeACoV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验验证。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 Ct值与标准品模板在9.47×101拷贝/μL~9.47×107拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.91。本实验建立的方法对PEDV、TGEV、PDCo V、PRRSV等猪常见腹泻病样品检测无扩增,表明特异性良好;敏感性试验结果显示,该方法检测下限可达到9.47×101拷贝/μL;重复性试验结果显示,组内变异系数在0.82%~1.01%,组间变异系数在1.20%~1.69%,重复性较好。采用本研究建立的方法对广西和云南等地70份临床样品进行检测,结果显示除阳性对照外,临床样品均为阴性,表明该病毒尚未传播至广东以外的省份。本实验首次建立了SeACoV N基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,为SeACoV快速检测和病毒感染预防提供技术手段。 展开更多
关键词 猪肠道α冠状病毒 N基因 荧光定量PCR
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广西3株牛源PCV2全基因组克隆与序列分析
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作者 孙文超 汪伟 +8 位作者 辛佳亮 张世亨 黄海鑫 曹亮 郑敏 张红云 韦显凯 鲁会军 金宁一 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2019年第10期1897-1901,共5页
为研究广西地区牛源PCV2流行毒株基因组特性和遗传进化情况,运用PCR技术对广西地区采集的210份牛血清进行检测,结果其中35份样品为PCV2阳性。将3份阳性样品进行全基因组克隆与序列分析,分别命名为PCV2/GX-B2(1 769 nt)、PCV2/GX-B131(1 ... 为研究广西地区牛源PCV2流行毒株基因组特性和遗传进化情况,运用PCR技术对广西地区采集的210份牛血清进行检测,结果其中35份样品为PCV2阳性。将3份阳性样品进行全基因组克隆与序列分析,分别命名为PCV2/GX-B2(1 769 nt)、PCV2/GX-B131(1 768 nt)、PCV2/GX-B132(1 767 nt)。同源性显示与猪DK1980PMWS-free株同源性最低(94%),与牛源的Buffalo2株同源性最高(98.6%)。遗传进化分析,3株牛源PCV2毒株均属于PCV2d基因型。本研究报道了PCV2在我国广西地区牛群中的感染情况,并发现广西地区牛群中PCV2的主要流行基因亚型为PCV2d。 展开更多
关键词 PCV2 进化分析
猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用
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作者 辛佳亮 汪伟 +6 位作者 杜倩 韩知晓 闭璟珊 曹亮 孙文超 方志超 郑敏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期834-840,共7页
为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoVM基... 为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoVM基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10^8~6.57×10^1copies/L范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10^1copies/L;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。 展开更多
关键词 猪德尔塔病毒 SYBRGreenⅠ 荧光定量PCR
山羊IL-1βIL-8和Mx1因子实时荧光定量检测方法的建立 预览
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作者 孙文超 易驰喆 +11 位作者 汪伟 曹亮 张世亨 闭璟珊 韦显凯 辛佳亮 李文杰 张克龙 郑敏 鲁会军 张红云 苏姣秀 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第1期3-6,共4页
根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧... 根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧光定量PCR反应的标准曲线、熔解曲线。结果表明,羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R^2均大于0.990,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰。应用所建立的方法对山羊痘病毒AV41感染山羊外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-8和Mx1 mRNA表达水平进行检测,山羊痘病毒AV41可以刺激机体产生较高的炎性细胞因子。建立的羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量检测方法,可以为山羊痘病毒感染后分子免疫机制研究奠定基础。 展开更多
关键词 山羊 炎性细胞因子和Mx1因子 REAL-TIME PCR
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非典型猪瘟病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 曹亮 田明尧 +7 位作者 孙文超 郭丹丹 汪伟 鲁会军 刘云霞 郑敏 钱爱东 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期622-626,共5页
参照GenBank上登录的非典型猪瘟病毒(atypical porcine pestivirus virus,APPV)全基因组序列设计特异性引物成功从感染APPV阳性样品中扩增出270 bp的APPV基因片段,并将其克隆到pEASY-Bluent Zero Cloning Kit载体,以纯化的重组质粒为模... 参照GenBank上登录的非典型猪瘟病毒(atypical porcine pestivirus virus,APPV)全基因组序列设计特异性引物成功从感染APPV阳性样品中扩增出270 bp的APPV基因片段,并将其克隆到pEASY-Bluent Zero Cloning Kit载体,以纯化的重组质粒为模板优化反应条件,建立了检测APPV的特异性荧光定量PCR方法。结果显示,建立的荧光定量PCR方法C_t值与标准品在1.49×10~1~1.49×10~(10) copies/μL呈现良好的线性关系,相关系数为R~20.999,斜率为-3.442,扩增效率为95.207%。该方法与PCV2、PRV、PRRSV、PPV及CSFV基因组均无交叉反应,敏感性比常规PCR高出1 000倍,组内和组间重复试验变异系数均小于2%。对临床采集的20份疑似感染APPV的样品进行检测,结果显示应用所建立的荧光定量PCR成功检测到3份APPV阳性样品,而常规PCR仅检测到1份,表明所建立的荧光定量PCR比常规PCR灵敏度更高。本试验所建立的APPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,可实现对APPV早期诊断及感染进行定量分析检测。 展开更多
关键词 非典型猪瘟 仔猪先天震颤 荧光定量PCR
重组猪源 IFN-λ1 植物乳杆菌的构建与表达验证 预览
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作者 付婷婷 马彬尧 +6 位作者 王茂鹏 韩继成 许汪 陈竞 姜宇航 金宁一 李昌 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期35-39,43共6页
为构建猪源3型干扰素(pIFN-λ1)的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含有植物乳杆菌锚定信号肽的猪源IFN-λ1基因(pIFN-λ1),插入到pSIP411表达载体电转入到中间克隆宿主菌NZ3900中,获得重组质粒pSIP-pIFN-λ1;再次电转入到表... 为构建猪源3型干扰素(pIFN-λ1)的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含有植物乳杆菌锚定信号肽的猪源IFN-λ1基因(pIFN-λ1),插入到pSIP411表达载体电转入到中间克隆宿主菌NZ3900中,获得重组质粒pSIP-pIFN-λ1;再次电转入到表达宿主植物乳杆菌Lp18获得重组植物乳杆菌;制备重组植物乳杆菌并验证其表达。结果显示,成功扩增出650bp目的条带,电转入植物乳杆菌Lp18中成功构建重组Lp18:pSIP-pIFN-λ1。WesternBlot、免疫荧光和流式细胞分析等方法验证重组蛋白pIFN-λ1的表达,获得阳性结果,阳性率为22.96%,且进一步证明其展示并锚定在植物乳杆菌表面。本试验成功构建了1株能稳定表达猪源IFN-λ1蛋白的重组植物乳杆菌,为猪源IFN-λ1的开发应用研究提供理论基础。 展开更多
关键词 3型干扰素 植物乳酸菌 构建与表达
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猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立
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作者 孙文超 汪伟 +13 位作者 赵翠青 赵海洋 刘立明 孟娟 王茂鹏 陈征 曹亮 陆依婷 夏秀秀 孙迪菲 宋璟子 郑敏 鲁会军 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期393-396,共4页
为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩... 为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩增其他猪常见病毒;PCV3和PCV2的最低检出限分别为508,412 copies/μL。临床样品检测结果显示,PCV3和PCV2阳性率分别为2.1%(3/145),62.1%(90/145),PCR产物经测序证实为PCV3。本研究建立的二重PCR方法具有速度快、特异性强和灵敏度等优点,可以用于PCV3和PCV2的检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 二重PCR方法 PCV3 PCV2
广西猪细小病毒6型VP1基因序列进化分析
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作者 尹柏双 赵翠青 +2 位作者 刘立明 沙万里 李国江 《畜牧与兽医》 北大核心 2019年第4期70-73,共4页
为研究广西地区是否存在猪细小病毒6型(PPV6)毒株流行,分析PPV6毒株遗传进化和分子特征,采用PCR技术对广西地区采集的猪组织样品进行PPV6基因片段检测。结果表明,广西地区猪群存在PPV6,感染率为36%(27/75),同时也存在着PPV6与猪圆环病毒... 为研究广西地区是否存在猪细小病毒6型(PPV6)毒株流行,分析PPV6毒株遗传进化和分子特征,采用PCR技术对广西地区采集的猪组织样品进行PPV6基因片段检测。结果表明,广西地区猪群存在PPV6,感染率为36%(27/75),同时也存在着PPV6与猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染现象,感染率为32%;5株PPV6 VP1基因与中国参考株TJ株、韩国参考株KSU1-AZ-2014株、美国参考株U18-4株、波兰参考株P15-1株核苷酸序列同源性分别为99.3%~99.8%,99.3%~99.8%,98.9%~99.8%,99.3%~99.8%;VP1基因遗传进化分析表明,PPV6包含两个基因亚群,5株PPV6与中国参考株BJ、SC、JS、TJ株及波兰参考株处在G2亚群,而美国U18-4株则单独处于一个G1亚群。本研究为中国PPV6毒株流行病学及其病毒致病性研究提供研究基础。 展开更多
关键词 猪细小病毒6型 VP1基因 遗传进化 广西
猪非典型瘟病毒GX01-2018株全基因组分子特征的分析
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作者 尹彦文 施开创 +3 位作者 孙文超 莫胜兰 陆文俊 屈素洁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期484-492,共9页
猪非典型瘟病毒(APPV)被证实是新生仔猪先天性震颤的致病因子。为了解广西APPV流行毒株的分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增APPV阳性病料,经克隆、测序、拼接,获得1株APPV的全基因序列,遂被命名为GX01-2018株。结果显示,GX01-2018株基因... 猪非典型瘟病毒(APPV)被证实是新生仔猪先天性震颤的致病因子。为了解广西APPV流行毒株的分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增APPV阳性病料,经克隆、测序、拼接,获得1株APPV的全基因序列,遂被命名为GX01-2018株。结果显示,GX01-2018株基因组全长11 565 bp,包括一个编码3 635个氨基酸的阅读框(ORF)。同源性分析显示,GX01-2018株与国内代表毒株广西GX-CH_2016株、江西JX-JM01-2018A01株、广东China/GD-SD/2016株、广东GD株核苷酸序列的同源性分别为98.2%、92.9%、83.4%、90.8%。GX01-2018株与国外代表毒株美国000515株、德国Bavaria_S5/9株、奥地利AUT-2016_C株、荷兰NL1株核苷酸序列的同源性分别为87.8%、90.7%、90.5%、90.7%。上述国内外代表毒株间Npro、Erns、E2基因核苷酸序列的同源性分别为79.1%~97.2%、83.0%~98.4%、83.1%~96.8%。基于APPV全基因组以及E2、Npro、Erns基因核苷酸序列绘制遗传进化树,获得相似的进化树图。来自广西的GX01-2018株与欧洲型毒株位于一个分支,而同样来自广西的GX04/2017株与美洲型毒株位于另一个分支。表明APPV流行毒株具有遗传多样性,来自同一地区的流行毒株出现较大的遗传变异。 展开更多
关键词 猪非典型瘟病毒 基因组序列 遗传变异 遗传多样性 分子特征
基孔肯雅病毒E2蛋白的原核表达及纯化
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作者 郭丹丹 曹亮 +7 位作者 田明尧 鲁会军 孙文超 张涵 汪伟 刘云霞 金宁一 郭焱 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第9期936-940,共5页
目的原核表达并纯化基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)E2主要结构蛋白,为预防CHIKV感染及亚单位疫苗的研究奠定基础。方法根据Gen Bank上公布的CHIKV基因序列合成E2基因,并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物并以合成... 目的原核表达并纯化基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)E2主要结构蛋白,为预防CHIKV感染及亚单位疫苗的研究奠定基础。方法根据Gen Bank上公布的CHIKV基因序列合成E2基因,并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物并以合成的E2基因为模板,PCR扩增CHIKV E2,连接到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达质粒p ET-28a-CHIKV E2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后进行纯化。结果重组原核表达质粒p ET-28a-CHIKV E2经双酶切鉴定构建正确,测序结果与原序列一致。表达的CHIKV E2融合蛋白相对分子质量约为47 000,可与His标签抗体特异性结合,纯化后纯度达95%以上。结论成功在大肠埃希菌中表达了CHIKV E2蛋白,纯化后蛋白纯度较高,为CHIKV亚单位疫苗的免疫试验奠定了基础。 展开更多
关键词 基孔肯雅病毒 原核表达 纯化
表达高致病性PRRSV GP3和GP5基因的核酸疫苗构建及小鼠免疫效果评价 被引量:1
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作者 赵冠宇 解长占 +8 位作者 李卓昕 张赫 孙文超 马彬尧 张克龙 李成辉 鲁会军 张英 金宁一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第8期805-808,818共5页
目的构建针对美洲型蓝耳病病毒的重组核酸疫苗,评价其与5种佐剂联合免疫BALB/C小鼠的效果。方法构建含有美洲型蓝耳病病毒GP3基因和GP5基因以及CpG-佐剂序列的重组核酸疫苗pVAX-N35HP,分别加入A1佐剂、A2佐剂、A3佐剂、A4佐剂和A8佐剂,... 目的构建针对美洲型蓝耳病病毒的重组核酸疫苗,评价其与5种佐剂联合免疫BALB/C小鼠的效果。方法构建含有美洲型蓝耳病病毒GP3基因和GP5基因以及CpG-佐剂序列的重组核酸疫苗pVAX-N35HP,分别加入A1佐剂、A2佐剂、A3佐剂、A4佐剂和A8佐剂,免疫BALB/C小鼠,通过中和性抗体、T淋巴细胞亚群及细胞因子检测分析免疫效果。结果成功构建重组核酸质粒pVAX-N35-HP。用重组核酸质粒转染BHK-21细胞,Western blot显示重组核酸质粒稳定表达目的蛋白。中和性抗体结果显示,重组核酸疫苗免疫后35d,pVAX-N35HP+A1组和pVAXN35HP+A2组抗体滴度为1∶12;pVAX-N35HP+A3组抗体滴度为1∶16。pVAX-N35HP组细胞因子IL-4含量为阴性对照组的1.39倍,CD4+T淋巴细胞亚群百分率为阴性对照组的2.35倍(P〈0.01)。重组核酸质粒分别与5种佐剂联合免疫小鼠,pVAX-N35HP+A1组CD8+T淋巴细胞亚群百分率为pVAX-N35HP组的1.93倍;pVAX-N35HP+A3组免疫细胞因子IL-4为pVAX-N35HP组的1.41倍(P〈0.05),IFN-γ为pVAX-N35HP组的3.79倍(P〈0.01);pVAX-N35HP+A2、pVAX-N35HP+A4和pVAX-N35HP+A8组IFN-γ水平升高,CD8+T淋巴细胞数量增多。结论成功构建重组核酸疫苗pVAX-N35HP。该疫苗具有良好的免疫原性,其中A1、A3免疫佐剂的加入可增强小鼠细胞免疫和体液免疫水平。 展开更多
关键词 HP-PRRSV 重组核酸质粒 佐剂 免疫评价
猪细小病毒6型SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立 被引量:7
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作者 孙文超 刘立明 +8 位作者 赵翠青 汪伟 赵冠宇 曹亮 张赫 庄忻雨 韩继成 鲁会军 金宁一 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期442-445,452共5页
采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-... 采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-time PCR方法Ct值与标准品模板在8.80×10^9-8.80×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.993,斜率为-4.320。该方法检测灵敏度可达8.80×10^1 copies/μL。该方法对JEV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV等猪常见病原检测均无特异性扩增;对临床样品的检测结果表明,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为40.63%。本试验成功建立了PPV6SYBR Green I real-time PCR检测方法,可实现对PPV6快速灵敏的诊断。 展开更多
关键词 猪细小病毒6型 SYBR Green I 荧光定量PCR
猪圆环病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量:2
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作者 李卓昕 温树波 +9 位作者 孙文超 赵冠宇 庄忻雨 解长占 张赫 肖朋朋 韩继成 高旭 鲁会军 金宁一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第9期934-938,944共6页
目的建立针对PCV3的操作简单、重复性好、灵敏度较高的检测方法。方法利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段(312bp),将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒。优化反应条件,建立定量检测PCV3的实时荧光定量... 目的建立针对PCV3的操作简单、重复性好、灵敏度较高的检测方法。方法利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段(312bp),将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒。优化反应条件,建立定量检测PCV3的实时荧光定量PCR方法,并进行敏感性、特异性和重复性验证。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法的Ct值与标准品模板在4.24×10^1-4.24×10^8拷贝/μl范围内呈良好线性关系,其相关系数为0.996,斜率为-4.384。该方法特异性强,与PRRSV、FMDV、JEV、PCV2及PRV均无交叉反应;敏感性为4.24×10^1拷贝/μl,比常规PCR方法高10倍;组间和组内重复试验的变异系数均小于2%。利用实时荧光定量PCR方法对采集的155份猪肺组织进行检测,阳性率为36.13%,高于普通PCR阳性检出率的32.25%。结论建立的PCV3SYBR GreenⅠReal-time PCR方法敏感、特异,可用于猪体PCV3感染的快速检测。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 建立 应用
寨卡病毒E蛋白的原核表达及鉴定 被引量:1
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作者 张涵 曹亮 +6 位作者 鲁会军 田明尧 孙文超 郭丹丹 汪伟 金宁一 李太元 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第7期681-684,690共5页
目的应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白,并对反应条件进行优化,为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础。方法从GenBank检索ZIKV基因组,合成E基因并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物,以合成的E基因为模板PCR扩增ZI... 目的应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白,并对反应条件进行优化,为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础。方法从GenBank检索ZIKV基因组,合成E基因并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物,以合成的E基因为模板PCR扩增ZIKV E基因,用BamHI和HindIII进行双酶切后连接表达载体pET-28a,构建原核表达重组质粒pET28a-ZIKV E,转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,并对最适IPTG诱导浓度进行优化。结果 pET28a-ZIKV E经酶切及测序鉴定均构建正确。用重组质粒转化DE3,当加入IPTG终浓度为2mmol/L,成功表达出分子质量单位(Mr)为56×103重组ZIKV E蛋白,与理论分子质量相符合。Western blot检测重组蛋白可被His标签抗体识别。结论成功构建原核重组载体pET-28a-ZIKV E,表达的重组蛋白具有免疫反应性,为ZIKV亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 寨卡病毒 E蛋白 原核表达 鉴定
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